Nous sommes en 2025 après Jésus-Christ et une ère nouvelle est arrivée. Depuis quelques années, l'utilisation de l'Animus s'est généralisé à tout le Continent Européen. A présent, des centaines de personnes retraces la vie de leur ancêtre par les machines d'Abstergo. Pour contrer le phénomène, un nouvel ordre a été créé par le Grand Desmond. Les Assassins se lancent à la poursuite des Templiers cherchant les fragments d'Eden en toute l'Italie.
A cela s'ajoute les quelques Mercenaires de ce monde cherchant ces mêmes fragments pour les revendre ensuite au plus offrant.
Et dans l'animus, une véritable guerre fait rage en 1506 après Jésus-Christ. Les Templiers se sont entrainés, les Assassins sont devenus plus forts et les Mercenaires sont plus puissants que jamais.